Exercises
Sie versuchen anhand der sogannten semi-quantitativen RT-PCR zu belegen, dass Ihr Traum-Gen in menschlichen Hautzellen exprimiert wird. Zunächst isolieren Sie mRNA aus den Zellen und stellen mit Hilfe der reversen Transkriptase eine cDNA-library (complementaryDNA) her. Diese cDNA-library dient als Template für die folgende PCR. Mit Hilfe der Gel-Elektrophorese können Sie nach der PCR herausfinden, ob Ihr Traum-Gen gar nicht, schwach oder stark im entsprechenden Gewebe exprimiert wird. Zum Testen Ihres Protokolls, und später als Referenz, benötigen Sie ein Kontroll-Gen. Besonders geeignet sind hierfür die sogenannten House-Keeping-Genes, die in jeder Zelle exprimiert werden. Sie haben sich für β-Actin (ACTB) mit der GenBank Accession Nummer NM_001101 entschieden.
Sie möchten eine DNA-Polymerase mit folgenden Thermo-Cycle Vorgaben verwenden:
Step Temperature (C) Time (min) Number of cycles Denaturation 95 0.5-1 25 - 40 Annealing 37-68 0.5-1 – Extension 72 1min/kb – Final Extension 72 5-15 1
- Finden Sie die cDNA Sequenz von NM_001101 bei NCBI und laden Sie die Sequenz herunter.
- Benutzen Sie die aufgeführten Web-Tools, um geeignete Primer zu bestimmen, die für den Thermo-Cycle Vorgaben entsprechen und möglichst wenig Sekundärstrukturen bilden. Beginnen Sie mit dem Primer3-Webtool, welches automatisch Primer zu einer Sequenz bestimmt. Benutzen Sie die anderen Tools, um die geählten Primer zu verifizieren und ggf. zu modifizieren.
- Vergleichen Sie die Ergebnisse der verschiedenen Tools.
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Für weitergehende Expressions-Experimente möchten Sie das humane β-Actin (NM_001101) in einen Expressionsvektor klonieren. Der Expressionsvektor ist ein bakterielles Plasmid, welches unter anderem eine sogenannte Multiple Cloning Site (MCP) enthält. Die MCP ist eine Region, die mehrere Restriktionsenzym-Schnittstellen enthält. Zum Klonieren des Gens müssen Sie ihr zukünftiges Insert zunächst mittels der PCR von ihrer cDNA library vervielfältigen und beide Gen-Enden mit einer Restriktions-Seite versehen. Die Multiple Cloning Site (MCP) enthaelt Schnittstellen für folgende Restriktionsenzyme hinter dem Promotor:
Enzyme Cleavage Site EcoRI 5'-G^A A T T C-3' 3'-C T T A A^G-5' HindIII 5'-A^A G C T T-3' 3'-T T C G A^A-5' PstI 5'-C T G C A^G-3' 3'-G^A C G T C-5'
Mögliche Downstream-Schnittstellen:
Enzyme Cleavage Site SmaI 5'-C C C^G G G-3' 3'-G G G^C C C-5' XhoI 5'-C^T C G A G-3' 3'-G A G C T^C-5' NcoI 5'C^C A T G G-3' 3'-G G T A C^C-5' Erstellen Sie Primer zur Klonierung des Gens, welche
- den Gen-Start und das Gen-Ende einschließen
- eine der möglichen Restriktionsenzym-Seiten am jeweiligen Ende enthalten.
Fügen Sie am Ende des Primers eine sogenannte GC-Klammer an (GCGC). Der Primer sollte nicht länger als 35 bp sein und möglichst wenig Sekundärstrukturen bilden. Sie möchten dieselbe DNA-Polymerase wie zuvor verwenden.
- Überprüfen Sie mit Hilfe von BLAST, ob Ihre Primer auch unspezifisch an anderen Genen des menschlichen Genoms binden! Dies wäre problematisch.
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