Applied Bioinformatics [Primer design]

Exercises

Primer für PCR

Primer sind kurze DNA-Moleküle (maximal 30 nt), die von DNA-replizierenden Enzymen, z.B. der DNA-Polymerase, als Startpunkt benötigt werden. Sie sind kurz genug, um sich bei der entsprechenden Temperatur spontan an die richtige Stelle im vorhandenen, komplementären DNA-Strang anzulagern und ermöglichen damit den Beginn der Replikation. Primer werden z.B. für die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) benötigt, eine Technik zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten.

Die PCR besteht aus drei, sich zyklisch wiederholenden Phasen:

  1. Schmelzen: Der Doppelstrang trennt sich in zwei Einzelstränge, hohe Temperatur
  2. Kühlen: Die Primer legen sich auf die entsprechenden Replikations-Start-Punkte am komplementären Strang, niedrigere Temperatur
  3. Verlängerung: Die Polymerase synthetisiert am Primer beginnend einen neuen komplementären DNA Strang

Kritische Punkte, die über den Erfolg einer PCR entscheiden, sind unter anderem

Primerdesign

Web-Tools für Primer-Design helfen dabei, Primer zu identifizieren, die möglichst wenig Sekundärstrukturen bilden (ΔG<-10 ist ungünstig) und zum PCR Temperatur-Zyklus passen.

Web-Tools für Primerdesign helfen dabei, mögliche Primer zu identifizieren. Diese sollten möglichst wenig Sekundärstrukturen bilden und zu dem PCR-Temperaturzyklus passen. Generell gibt es zwei Arten von Tools:

  1. Tools zur automatischen Auswahl von Primern anhand einer Eingabesequenz (beispielsweise der kompletten cDNA) und diverser Konstanten, die meist eine fertige Primersequenz (5'- 3') liefern (Bsp Primer3).
    Wichtige Parameter, die in dem Web-Interface gesetzt werden sollten:
    • Primergröße: 1. Bindungsspezifität des Primers (je kürzer, desto unspezifischer); 2. Wahrscheinlichkeit Sekundärstrukturen zu bilden (je Länger, desto eher bilden sich Sekundärstrukturen); 3. Kosten (je länger, desto teurer.
    • Schmelztemperatur (Tm): Der Primer muss sich mindestens bei der im PCR-Programm angegebenen Schmelztemperatur lösen. Die Primer Tm muss oberhalb von der Synthesetemperatur (Extensiontemp.) liegen und unterhalb der Temperatur bei der die verwendete Polymerase denaturiert.
    • Gewünschte größe des Produktes: PCR fürs Klonieren von Genen (ganzes Gen muss amplifiziert werden) oder quantitaive PCR (Produkt muss auf dem Gel nachweisbar sein, mind. 200 BP).
    • Salzkonzentration: Hängt vom Protokoll ab (in den Aufgaben nicht einbezogen)
  2. Tools zur Berechnung von Konstanten (melting temperature Tm) und Sekundärstrukturen für existierende oder von Hand ausgewählte Primer, wenn man beispielsweise eine Restrictionssite anhängen will (Bsp NetPrimer).
    • Man muss sich bewusst machen, dass die Sequenz aus der Datenbank in 5' - 3'-Richtung angegeben ist und dass die DNA-Polymerase am 3'-Ende des Primers die Kette verlängert.
      Der Forward Primer kann einfach als Subsequenz der vorliegenden Sequenz ausgewäh;lt werden.
      Der Reverse Primer entspricht dem reversen Komplement einer Subsequenz der vorliegenden Sequenz.

Web-Tools zur Übung

Weitere Infos


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